T細(xi)胞來(lai)源確(que)認(ren)：
外周(zhou)血單(dan)個核(he)細胞(bao)（PBMC）需新鮮(xian)分(fen)離（采血(xue)後6小(xiao)時(shi)內處理(li)），活(huo)細胞率(lv)≥95%；
冷(leng)凍保(bao)存(cun)的T細(xi)胞(bao)復蘇後，需經(jing)流式細(xi)胞(bao)術(shu)檢測CD3+細(xi)胞(bao)比(bi)例（目標值(zhi)≥85%）。
無菌(jun)操(cao)作(zuo)規範(fan)：
實(shi)驗全(quan)程在生物(wu)安全(quan)櫃(gui)內進(jin)行，臺(tai)面用75%乙醇(chun)消(xiao)毒，紫(zi)外照(zhao)射(she)30分(fen)鐘；
操(cao)作人員(yuan)穿(chuan)戴(dai)無菌(jun)手套(tao)、口(kou)罩，避免交(jiao)叉(cha)汙(wu)染(ran)。
T細(xi)胞(bao)激(ji)活(huo)試劑(ji)盒(he)的操(cao)作(zuo)流程
（壹）激(ji)活(huo)體系配(pei)制(zhi)
抗體(ti)包被(bei)步驟(zhou)：
用(yong)PBS稀(xi)釋CD3抗(kang)體至5μg/ml，每(mei)孔加入50μl，4℃包被(bei)過夜或(huo)37℃孵(fu)育2小(xiao)時(shi)；
棄去(qu)包被(bei)液，用PBS洗滌3次，去(qu)除未結合(he)抗(kang)體(ti)（每(mei)次洗滌後離心5分(fen)鐘，200g）。
細(xi)胞重(zhong)懸(xuan)與(yu)刺激(ji)：
將T細胞調整至(zhi)1×10⁶cells/ml，加(jia)入含10%FBS的RPMI1640培養(yang)基(ji)；
每(mei)孔加入100μl細胞懸(xuan)液(ye)，再(zai)添(tian)加(jia)CD28抗體（終(zhong)濃(nong)度(du)1μg/ml）及(ji)IL-2（50U/ml），37℃培養(yang)。
（二(er)）培養(yang)與(yu)監測
培養(yang)條(tiao)件(jian)控(kong)制(zhi)：
每(mei)24小(xiao)時(shi)觀察細胞形(xing)態（正常激(ji)活(huo)細胞(bao)呈圓形或短梭(suo)形(xing)，聚集(ji)成簇(cu)）；
每(mei)3天半(ban)量(liang)換(huan)液(ye)（棄去(qu)50%上清，補充新(xin)鮮培養(yang)基(ji)），維持IL-2濃度(du)。
活(huo)性(xing)與(yu)增(zeng)殖檢測：
MTT法(fa)：培養(yang)第5天每(mei)孔加入20μlMTT溶(rong)液（5mg/ml），4小(xiao)時(shi)後溶(rong)解甲(jia)瓚(zan)，測(ce)定OD₅₇₀值(zhi)；
流式細(xi)胞(bao)術(shu)：標記CD25、CD69等激(ji)活(huo)標誌物(wu)，評估激(ji)活(huo)效率(lv)（目標激(ji)活(huo)率≥80%）。
（三）終(zhong)止培養(yang)與(yu)下遊應用(yong)
細(xi)胞收(shou)獲：
離心收(shou)集(ji)細胞(bao)（300g，5分(fen)鐘），用(yong)PBS洗滌2次，去(qu)除殘(can)留抗體(ti)；
用(yong)於(yu)CAR-T制(zhi)備時(shi)，需確保(bao)細(xi)胞活(huo)率≥90%，細(xi)胞濃度(du)1×10⁷cells/ml。
數(shu)據記錄(lu)：
記錄(lu)細(xi)胞形(xing)態、增(zeng)殖曲線、激(ji)活(huo)標誌物(wu)表(biao)達(da)等數(shu)據，繪(hui)制(zhi)趨勢圖(tu)；
異常結果（如(ru)激(ji)活(huo)率＜60%）需分(fen)析原(yuan)因(yin)（如(ru)抗(kang)體(ti)濃(nong)度(du)不(bu)足(zu)、汙(wu)染(ran)等）。
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更新時(shi)間：2025-07-01
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