T4 DNA 聚合(he)酶的(de)儲存(cun)條(tiao)件(jian)、熱失活參(can)數(shu)與反應體系(xi)優(you)化(hua)

溫(wen)度範圍

T4 DNA聚(ju)合(he)酶需在-20℃至-15℃的低(di)溫(wen)條(tiao)件(jian)下(xia)保(bao)存(cun)，部(bu)分(fen)產(chan)品(pin)在-20℃環(huan)境(jing)下(xia)可(ke)穩定(ding)保存(cun)2-3年。儲存(cun)液(ye)成(cheng)分(fen)通常(chang)包(bao)含(han)磷(lin)酸(suan)鉀緩(huan)沖(chong)液(ye)、EDTA、DTT及(ji)甘(gan)油，以(yi)維(wei)持酶活性(xing)並防(fang)止反復(fu)凍(dong)融導(dao)致(zhi)的(de)降解(jie)。

操(cao)作(zuo)規範

避免反(fan)復凍(dong)融：建(jian)議(yi)分(fen)裝後保存(cun)，每(mei)次取用僅(jin)解(jie)凍(dong)所需量。

運(yun)輸(shu)與臨時存(cun)放：若(ruo)需短期運(yun)輸(shu)或臨時存(cun)放，可(ke)使(shi)用幹(gan)冰或(huo)-80℃超(chao)低(di)溫(wen)冰箱(xiang)，並盡量縮(suo)短(duan)暴(bao)露(lu)於(yu)室(shi)溫(wen)的(de)時間(jian)。

二、熱失活參(can)數(shu)

標準失活條(tiao)件(jian)

T4 DNA聚(ju)合(he)酶可(ke)通(tong)過75℃加熱10-20分(fen)鐘實現(xian)失活。

應(ying)用場(chang)景

終(zhong)止反應(ying)：在(zai)DNA平末端制備或(huo)標記反應後，需通過熱失活終(zhong)止酶活性(xing)，防(fang)止過度消化(hua)。

兼容性(xing)：失活後的酶不(bu)會幹擾下(xia)遊(you)實驗(yan)，但(dan)需確(que)保(bao)失活條(tiao)件(jian)不(bu)破(po)壞DNA模板或(huo)產(chan)物(wu)。

三、反應(ying)體系(xi)優(you)化(hua)

核心(xin)反(fan)應(ying)條件(jian)

溫(wen)度與時間(jian)：

平末端制備：12℃反(fan)應(ying)15分(fen)鐘，利(li)用3'→5'外(wai)切(qie)酶活性(xing)修(xiu)飾DNA末端。

高(gao)保真合(he)成(cheng)：37℃反應5分(fen)鐘，按(an)終(zhong)濃度1 U/μl加入(ru)酶，確(que)保(bao)高(gao)效摻(chan)入(ru)脫(tuo)氧核(he)糖核(he)苷(gan)酸(suan)。

熱調(tiao)節SLIC克隆(long)：針對(dui)短(duan)同源(yuan)片段，50℃處(chu)理(li)30秒可(ke)提(ti)高(gao)克隆(long)效率(lv)，通過高(gao)溫(wen)破(po)壞DNA二(er)級(ji)結(jie)構(gou)，增強酶與模板的(de)結(jie)合(he)。

緩(huan)沖(chong)液(ye)組(zu)成(cheng)：

隨酶提(ti)供的10×反(fan)應(ying)緩(huan)沖(chong)液(ye)可(ke)優(you)化(hua)酶活性(xing)。需避免緩(huan)沖(chong)液(ye)汙(wu)染(ran)或(huo)ATP降解(jie)，必(bi)要(yao)時補充(chong)新(xin)鮮ATP。

酶用(yong)量調(tiao)整

標準用(yong)量：1μL 10×緩(huan)沖(chong)液(ye)+1μL T4 DNA聚(ju)合(he)酶用(yong)於(yu)1μg DNA的(de)10μL反(fan)應(ying)體系(xi)。

靈(ling)活調(tiao)整：

NGS文庫構(gou)建：按(an)終(zhong)濃度1 U/μl加入(ru)酶。

低(di)效率(lv)反應：可適當增(zeng)加酶量，但(dan)需避免過量導致(zhi)非(fei)特異性結合(he)或產(chan)物(wu)降解(jie)。

DNA底(di)物(wu)質(zhi)量

純(chun)度要(yao)求：通(tong)過瓊(qiong)脂(zhi)糖凝(ning)膠電泳(yong)或(huo)磁(ci)珠法(fa)純(chun)化(hua)DNA，去除(chu)蛋(dan)白(bai)質(zhi)、RNA等(deng)雜質(zhi)，防(fang)止抑制酶活性(xing)。

末端狀態：

平末端：加入(ru)5%-10%PEG-8000提(ti)高(gao)局部DNA濃度，增強(qiang)連(lian)接效率(lv)。

粘(zhan)性末端：確(que)保(bao)末端未被(bei)核酸(suan)外切(qie)酶降解(jie)，制備後盡快反(fan)應(ying)或-20℃保(bao)存(cun)。若(ruo)懷(huai)疑損(sun)傷，可用Klenow片段補平。

pH與離(li)子(zi)強度

最適pH：7.5-7.8，需定(ding)期檢(jian)查緩(huan)沖(chong)液(ye)pH值(zhi)，必(bi)要(yao)時用酸(suan)或堿微(wei)調(tiao)。

Mg²⁺濃度：緩(huan)沖(chong)液(ye)中(zhong)通常(chang)含(han)100 mM MgCl₂，過高(gao)或過低(di)均會影響酶活性(xing)，需嚴(yan)格按(an)說明(ming)書(shu)配(pei)制。

反應(ying)體積(ji)與操(cao)作(zuo)細節

體積(ji)優(you)化(hua)：推薦(jian)10-20μL反(fan)應體系(xi)，避免體積(ji)過小(xiao)導致(zhi)成(cheng)分(fen)不均。

操(cao)作(zuo)規範：使(shi)用精(jing)密(mi)移(yi)液(ye)器(qi)，避免氣泡(pao)產(chan)生(sheng)；酶切(qie)質(zhi)粒與目的片段摩爾比(bi)建(jian)議(yi)為1:3或(huo)1:4，減(jian)少假(jia)陽(yang)性。