Cell Star Protocol 重磅解析： 無(wu)標簽(qian)定量賴(lai)氨(an)酸乳(ru)酸化蛋白組分(fen)析方(fang)案(an)

L-乳(ru)酸被認(ren)為(wei)是信(xin)號(hao)傳導和代(dai)謝(xie)平(ping)衡的(de)關(guan)鍵分(fen)子。乳(ru)酰(xian)化，壹(yi)種由(you)L-乳(ru)酸衍生(sheng)的(de)蛋白質翻(fan)譯(yi)後修(xiu)飾(shi)（PTM），在多種蛋(dan)白質上(shang)普遍(bian)存在，並(bing)在細(xi)胞(bao)過程中(zhong)發(fa)揮重要作用。25年6月(yue)由(you)浙(zhe)江大學(xue)張(zhang)龍(long)教(jiao)授團(tuan)隊發表(biao)在《STAR Protocol》上(shang)的(de)《Protocol for label-free quantitative lysine lactylproteome profiling》介紹了壹(yi)種全面分(fen)析乳(ru)酰(xian)化蛋白質組並(bing)進(jin)行(xing)無(wu)標(biao)簽(qian)定量的(de)方法。作(zuo)者詳細(xi)介(jie)紹了細胞(bao)制(zhi)備、蛋(dan)白(bai)質提(ti)取、消化、肽(tai)脫(tuo)鹽(yan)及乳(ru)酰(xian)肽(tai)富集的(de)步(bu)驟。此(ci)外，還概述了液相(xiang)色譜-串(chuan)聯(lian)質譜（LC-MS/MS）分(fen)析的(de)參(can)數設(she)置(zhi)。

方(fang)案(an)概覽(lan)：

準(zhun)備工作(zuo)：

該方(fang)案(an)描述了在AARS1和AARS2（AARS1/2）敲(qiao)低、過表(biao)達以(yi)及(ji)野生(sheng)型細(xi)胞(bao)中(zhong)進(jin)行(xing)乳(ru)酸化分(fen)析的(de)定量方(fang)法。

實(shi)驗時(shi)需(xu)準(zhun)備以(yi)下(xia)材料(liao)：

1. 編(bian)碼(ma)AARS1/2的(de)哺(bu)乳(ru)動(dong)物細胞(bao)表(biao)達載(zai)體(ti)及(ji)針對(dui)AARS1/2的(de)siRNA

2. 在含有10%（體(ti)積(ji)比(bi)）胎(tai)牛血清、100 mg/mL青黴素(su)和鏈黴素(su)的(de)DMEM培(pei)養基(ji)中(zhong)培(pei)養HEK293T細(xi)胞和HeLa細(xi)胞(bao)

3. 將(jiang)細胞(bao)系(xi)置(zhi)於(yu)37C、5%二氧(yang)化碳的(de)濕潤(run)培(pei)養箱中(zhong)培(pei)養。定期檢(jian)測(ce)是否有(you)支原(yuan)體(ti)細(xi)胞汙染(ran)

4. 至(zhi)少每48小時更換壹(yi)次細胞(bao)培(pei)養基(ji)，吸出壹(yi)半舊(jiu)培(pei)養基(ji)（註意不要破壞細胞(bao)spheroids結(jie)構），並補充等(deng)量的(de)新鮮培(pei)養基(ji)

5. 校準(zhun)LC-MS設(she)備，並(bing)運(yun)行(xing)質量控(kong)制(zhi)樣(yang)本(ben)，如HeLa細(xi)胞(bao)裂解(jie)物標準(zhun)品，以(yi)確(que)保LC-MS/MS性能符合(he)預(yu)期

分(fen)步(bu)方法詳(xiang)解

• 細胞(bao)培(pei)養

時(shi)間：2天(tian)

本(ben)部(bu)分(fen)介紹了用於(yu)轉染(ran)的(de) HEK293T 細胞培(pei)養物的(de)制(zhi)備

• 37℃水(shui)浴中(zhong)預(yu)熱 DMEM、PBS 和胰(yi)蛋白(bai)酶(mei)-EDT

• 使(shi)用(yong)10 cm 培(pei)養皿(min)培(pei)養 HEK293T 細(xi)胞，在培(pei)養條(tiao)件為(wei)5% CO2和 37℃，使(shi)用(yong)DMEM 培(pei)養基(ji)培(pei)養直(zhi)至(zhi)達到(dao) 80%–90% 細(xi)胞密(mi)度

• 吸出生(sheng)長培(pei)養基(ji)並用 2 mL 無(wu)菌 PBS 輕(qing)輕(qing)清洗細胞兩次

• 吸出 PBS，加(jia)入 1 mL 胰(yi)蛋白(bai)酶(mei)-EDTA 分(fen)離(li)細胞(bao)，37℃孵育直(zhi)至(zhi)細胞分(fen)離(li)（約 30 秒(miao)

• 為(wei)了中(zhong)和胰(yi)蛋白(bai)酶(mei)-EDTA，添加(jia) 2 mL 生(sheng)長培(pei)養基(ji)並通(tong)過移液(ye)重新懸浮(fu)，直(zhi)到(dao)所(suo)有細(xi)胞從培(pei)養皿(min)底部(bu)剝離(li)

• 將(jiang)細胞(bao)懸(xuan)浮(fu)液轉移到 15 mL Falcon 管中(zhong)，在 22℃–25℃之間(jian)以 200 xg 離(li)心(xin) 3 分(fen)鐘，使(shi)細(xi)胞沈澱(dian)

• 吸出上(shang)清液並將(jiang)細胞(bao)沈澱(dian)物重懸在 1 mL 新(xin)鮮生(sheng)長培(pei)養基(ji)中(zhong)

• 將(jiang)四(si)分(fen)之壹(yi)的(de)細胞懸(xuan)浮(fu)液接(jie)種到(dao)壹(yi)個(ge)新(xin)的(de) 10 厘(li)米培(pei)養皿(min)中(zhong)，並(bing)添加(jia)額外的(de)8 毫升(sheng)新鮮生(sheng)長培(pei)養基(ji)

• 培(pei)養細(xi)胞直(zhi)至(zhi)其達到(dao)轉染(ran)所(suo)需的(de)最(zui)佳細(xi)胞(bao)密度(du)

• 細胞(bao)轉染(ran)

時間(jian)：60-120分(fen)鐘

將(jiang)AARS1/2 siRNA、AARS1/2質粒(li)或(huo)對照質粒(li)單獨(du)或(huo)組合(he)轉染(ran)至(zhi)HEK293T細胞中(zhong)。每(mei)次(ci)處(chu)理應至(zhi)少準(zhun)備兩個(ge)10 cm細(xi)胞(bao)培(pei)養皿(min)，以提(ti)供足(zu)夠的(de)蛋白質用(yong)於乳(ru)酰(xian)肽(tai)的(de)富集。在本(ben)方(fang)案(an)中(zhong)，我們使(shi)用(yong)聚乙烯(xi)亞胺(PEI)轉染(ran)AARS1/2構建體(ti)或(huo)對照質粒(li)，並使(shi)用脂(zhi)質體(ti)轉染(ran)siRNA。轉染(ran)所(suo)需的(de)siRNA、DNA構建體(ti)和轉染(ran)試劑(ji)用量見下(xia)面(mian)。

10、轉染(ran)前(qian)培(pei)養細(xi)胞直(zhi)至(zhi)其達到(dao) 40%–50% 細(xi)胞密(mi)度

11、使用(yong)不含血清的(de) DMEM 培(pei)養基(ji)稀釋(shi)表(biao)中(zhong)所(suo)示(shi)適量的(de) siRNA 或(huo)質粒(li)

註意(yi)：siRNA 應懸(xuan)浮(fu)於無(wu) RNase 的(de)水(shui)中(zhong)，並(bing)以(yi) 20–100 mM 的(de)濃度(du)儲存

• 使用無血清的(de) DMEM 培(pei)養基(ji)，按照表(biao)中(zhong)所(suo)示(shi)稀釋(shi)適量的(de)脂質體(ti)轉染(ran)試劑(ji)或(huo)PEI，將(jiang)其與稀釋(shi)的(de) siRNA 或(huo)質粒(li)混合(he)，室(shi)溫(wen)孵育 20 分(fen)鐘

• 將(jiang)DNA混合(he)物逐(zhu)滴(di)加(jia)入相(xiang)應(ying)的(de)培(pei)養皿(min)中(zhong)

• 將(jiang)轉染(ran)後的(de)細胞置(zhi)於(yu)37℃、5%二氧(yang)化碳的(de)培(pei)養箱中(zhong)孵育6小時

• 吸出培(pei)養基(ji)，更換為(wei)新鮮的(de)DMEM培(pei)養基(ji)

註意：在所(suo)有siRNA實(shi)驗中(zhong)，必(bi)須設(she)置(zhi)對(dui)照(zhao)組以(yi)評(ping)估(gu)靶(ba)向(xiang)基(ji)因(yin)敲低的(de)效(xiao)果(guo)

• 乳(ru)酸刺(ci)激(ji)

時間(jian)：1天(tian)

為(wei)了更全面地比(bi)較(jiao)不同(tong)實(shi)驗中(zhong)蛋(dan)白(bai)質乳(ru)酸化水(shui)平(ping)的(de)變化，除了常規(gui)培(pei)養的(de)細胞外，我們還建立(li)了壹(yi)個(ge)平(ping)行(xing)組，在該(gai)組中(zhong)，乳(ru)酸被添加(jia)到細(xi)胞(bao)培(pei)養基(ji)中(zhong)，以(yi)提(ti)高乳(ru)酸化的(de)水(shui)平(ping)。

16. 更換為(wei)新鮮的(de)DMEM培(pei)養基(ji)後，將(jiang)乳(ru)酸溶液(ye)以(yi)25 mM的(de)最(zui)終濃度(du)加(jia)入培(pei)養基(ji)中(zhong)

17. 在培(pei)養箱中(zhong)繼(ji)續(xu)孵育細胞24-36小時

• 細胞收獲和裂(lie)解(jie)

耗(hao)時(shi)：2小時

18. 小心(xin)地從細胞(bao)中(zhong)吸出培(pei)養基(ji)

19. 每次添加(jia) 2 mL 冰冷(leng) PBS 沖(chong)洗(xi)細(xi)胞兩次

20. 加(jia)入 1 mL PBS 並(bing)吹(chui)打直(zhi)至(zhi)所(suo)有細(xi)胞脫(tuo)離(li)培(pei)養皿(min)底部(bu)，從而(er)分(fen)離(li)細胞(bao)。將(jiang)細胞(bao)收集到(dao)新的(de) 1.5 mL Eppendorf 管中(zhong)

註(zhu)意(yi)：如(ru)果(guo)細(xi)胞粘附過度，無(wu)法通(tong)過移液(ye)器將(jiang)其從培(pei)養皿(min)底部(bu)取下(xia)，請(qing)使用(yong)細胞(bao)刮刀將(jiang)細胞(bao)分(fen)離(li)

21. 在 4℃ ，900 x g 離(li)心(xin) 10 分(fen)鐘，沈澱(dian)細(xi)胞

22. 吸出上(shang)清液。

註意：如(ru)果(guo)您(nin)計(ji)劃進(jin)行(xing) SILAC 實(shi)驗，請(qing)在此(ci)步(bu)驟中(zhong)計(ji)數(shu)細(xi)胞並混合(he)等(deng)量的(de)重同位素(su)標記(ji)細胞和對(dui)照(zhao)細胞

23. 用(yong) 500 mL denaturing lysis buffer重懸細胞沈澱(dian)

24. 使(shi)用ultrasonic Horn進(jin)行(xing)超(chao)聲處(chu)理以降低細胞裂解(jie)物粘度（共(gong) 2 分(fen)鐘；脈(mai)沖(chong)模式：開啟 2 秒(miao)，關(guan)閉 2 秒(miao)；幅度(du)設(she)置(zhi)為(wei) 35%）

註意：

• 應根據(ju)蛋白(bai)質的(de)量和蛋(dan)白(bai)質溶(rong)液的(de)體(ti)積(ji)來(lai)選(xuan)擇(ze)超(chao)聲的(de)尺寸和超(chao)聲波(bo)處(chu)理的(de)持續(xu)時間(jian)

• 使(shi)用(yong)冰浴以(yi)防(fang)止超(chao)聲處(chu)理過程中(zhong)蛋(dan)白(bai)質降解

25. 將(jiang)樣品(pin)在 4°C 下(xia)以(yi) 13000 x g 的(de)速度離(li)心(xin) 15 分(fen)鐘，以(yi)去(qu)除不溶(rong)性(xing)物質。將(jiang)上(shang)清液收集到(dao)壹(yi)個(ge)新(xin)的(de) 1.5 mL Eppendorf 管中(zhong)

• 蛋(dan)白(bai)質消化

耗(hao)時(shi)：0.5天(tian)

26. 使(shi)用(yong) BCA 分(fen)析法確(que)定細胞(bao)裂(lie)解物的(de)蛋白質濃度(du)，並分(fen)離(li) 2 mg 蛋白(bai)質進(jin)行(xing)消化

註意：BCA 檢測(ce)的(de)標準(zhun)曲線應覆蓋樣品(pin)預(yu)期濃度(du)的(de)整個(ge)範(fan)圍。每次(ci)檢(jian)測(ce)樣(yang)品(pin)都(dou)需(xu)要建立(li)標準(zhun)曲線

27.沈澱(dian)蛋(dan)白質

A、用(yong) 100 mM Tris-HCl、pH 8.5 將(jiang)裂解(jie)物溶液(ye)稀(xi)釋(shi)至(zhi) 4 M 尿素(su)

關(guan)鍵：濃度(du)為(wei) 8 M 時，添加(jia)丙酮(tong)後尿素(su)會沈澱(dian)出來(lai)，影(ying)響(xiang)蛋(dan)白(bai)質的(de)消化效(xiao)率(lv)

B、將(jiang)冰冷(leng)的(de)丙酮添加(jia)到裂(lie)解(jie)物溶液(ye)中(zhong)，並(bing)在 -20℃ 下(xia)孵育混合(he)物 30 分(fen)鐘，使(shi)用(yong)體(ti)積(ji)為(wei)裂解物溶液(ye)六(liu)倍

C、在 4℃ 下(xia)以(yi) 13000 x g 離(li)心(xin) 30 分(fen)鐘，使(shi)沈澱(dian)的(de)蛋白質沈澱(dian)下(xia)來(lai)。

暫(zan)停點(dian)：樣品(pin)可以在-80℃的(de)溫度下(xia)在此(ci)點(dian)保存長達1個(ge)月(yue)

28.用(yong) Lys-C 消化

A、用 500 μL 50 mM ABC 緩(huan)沖(chong)液(ye)重新懸浮(fu)蛋白(bai)質沈澱(dian)

註(zhu)意：50 mM ABC 緩(huan)沖(chong)液(ye)的(de) pH 應為(wei) 8.0。如果(guo) pH 值(zhi)偏差過大，請(qing)準(zhun)備新(xin)的(de)緩(huan)沖(chong)液(ye)

B、將(jiang) Lys-C 添加(jia)到裂(lie)解(jie)物中(zhong)，最(zui)終濃度(du)為(wei) 10 ng/μL

C、 37℃ 下孵育 3-4 小時。

關(guan)鍵：將(jiang)蛋白(bai)質顆(ke)粒懸(xuan)浮(fu)在轉速設(she)為(wei) 1500 rpm 的(de)培(pei)養搖(yao)床上(shang)

29.用胰(yi)蛋白(bai)酶(mei)消化

A、以 1:100 的(de)酶(mei)與底物比(bi)例將(jiang)胰(yi)蛋白(bai)酶(mei)添加(jia)到反應(ying)混(hun)合(he)物中(zhong)

B、在 37℃ 下(xia)孵育 12 小時

30.肽(tai)還原(yuan)和烷(wan)基(ji)化

A、將(jiang) 5 μL  1 M TCEP 緩(huan)沖(chong)液(ye)加(jia)入蛋(dan)白(bai)消化液中(zhong)，充分(fen)混勻(yun)，25℃ 孵育 15 分(fen)鐘

B、將(jiang) 10 μL  500 mM IAA 緩(huan)沖(chong)液(ye)加(jia)入蛋(dan)白(bai)消化液中(zhong)。混(hun)勻(yun)，25℃避(bi)光(guang)孵育 20 分(fen)鐘

關(guan)鍵：IAA 對(dui)光不穩(wen)定，烷(wan)基(ji)化應在黑(hei)暗中(zhong)進(jin)行(xing)。

31. 通(tong)過添加(jia) TFA 至(zhi)最(zui)終濃度(du)為(wei) 1% 來(lai)終(zhong)止消化

32. 在室(shi)溫(wen)下(xia)以 13000 x g 的(de)速度離(li)心(xin)樣(yang)品(pin) 5 分(fen)鐘，以(yi)去(qu)除不溶(rong)性(xing)物質

33. 將(jiang)上(shang)清液轉移到新的(de) 5 mL Eppendorf 管中(zhong)進(jin)行(xing)肽(tai)脫(tuo)鹽(yan)

• 肽(tai)脫(tuo)鹽(yan)

耗(hao)時(shi)：0.5天(tian)

文中(zhong)使(shi)用(yong)reverse-phase Strata-X 33 mm Polymeric sorbent solid-phase extraction cartridges 柱(zhu)體(ti)尺(chi)寸的(de)選(xuan)擇(ze)應(ying)基(ji)於消化蛋白的(de)量，約(yue)為(wei)填料重量的(de) 10% (wt/wt)。

34.用 1 mL 脫(tuo)鹽(yan)活化緩(huan)沖(chong)液(ye)cartridges

關(guan)鍵：洗(xi)脫(tuo)步(bu)驟前(qian)請(qing)勿排(pai)空(kong)濾(lv)芯。每(mei)個(ge)步(bu)驟結(jie)束(shu)時，濾(lv)芯上(shang)方應(ying)保留(liu)壹(yi)層液體(ti)。

35.使(shi)用 2 mL SPE 平(ping)衡緩(huan)沖(chong)液(ye)平(ping)衡cartridges

36.裝(zhuang)入收集的(de)肽(tai)溶液。

註意：樣(yang)品通(tong)過後，catridges可能會變黃(huang)，這表(biao)明(ming)已(yi)經(jing)進(jin)行(xing)了還原(yuan)和烷(wan)基(ji)化。

37.用 2 mL SPE 平(ping)衡緩(huan)沖(chong)液(ye)清洗。

38.用 1 mL SPE 洗脫(tuo)緩(huan)沖(chong)液(ye)洗(xi)脫(tuo)，並(bing)將(jiang)洗脫(tuo)液(ye)收集到(dao)新的(de) 1.5 mL Eppendorf 管中(zhong)

39.分(fen)離(li) 50 μL  洗脫(tuo)液(ye)（100 μg 細胞裂解液(ye)肽(tai)）並用離(li)心(xin)機(ji)幹燥(zao)

註意(yi)：分(fen)離(li)的(de)肽(tai)將(jiang)用於(yu)蛋(dan)白質組分(fen)析

40.用(yong)液氮(dan)冷(leng)凍洗脫(tuo)液(ye)，然後將(jiang)其凍幹

關(guan)鍵：

• 凍幹，並(bing)去(qu)除樣品中(zhong)的(de)所(suo)有殘(can)留(liu)酸，以便(bian)進(jin)行(xing)下(xia)壹(yi)步(bu)的(de)乳(ru)肽(tai)富集步(bu)驟

• 凍幹粉(fen)應(ying)呈黃(huang)白色蓬松狀。如(ru)果(guo)無(wu)法凍幹，請(qing)使用(yong) SpeedVac 離(li)心(xin)機(ji)幹燥(zao)洗脫(tuo)液(ye)

暫停點：樣品(pin)可以在-80℃的(de)溫度下(xia)在此(ci)點(dian)保存長達1個(ge)月(yue)

• 乳(ru)酸化肽(tai)段(duan)富集

耗(hao)時(shi)：0.25天(tian)

使(shi)用(yong)抗(kang)L-乳(ru)酰(xian)賴氨(an)酸抗體(ti)偶(ou)聯瓊脂(zhi)糖(tang)珠（可使用(yong)斯(si)達特(te)Anti-L-lactyllysine agarose Beads替(ti)代，貨(huo)號(hao)：S0F0003，用(yong)量可根據(ju)說明(ming)書(shu)及(ji)樣本情(qing)況進(jin)行(xing)調(tiao)節(jie)）。珠(zhu)子的(de)用量應(ying)根(gen)據(ju)消化的(de)蛋白質量確(que)定。在本(ben)方(fang)案(an)中(zhong)，每(mei)2 mg蛋(dan)白(bai)質消化物建議(yi)使(shi)用(yong)10 μL抗L-乳(ru)酰(xian)賴氨(an)酸抗體(ti)偶(ou)聯瓊脂(zhi)糖(tang)珠（圖1）。在每(mei)個(ge)步(bu)驟中(zhong)，使(shi)用(yong)微量離(li)心(xin)機(ji)在4℃下(xia)以(yi)1000 x g離(li)心(xin)1分(fen)鐘，使(shi)珠(zhu)子沈澱(dian)

圖(tu) 1 利用(yong) Anti-L-lactyllysine agarose Beads富集乳(ru)酰(xian)肽(tai)的(de)示(shi)意圖

註(zhu)意(yi)：在正(zheng)式實(shi)驗前(qian)，研(yan)究(jiu)人員(yuan)應應用HeLa細(xi)胞(bao)裂解物等(deng)標(biao)準(zhun)品進(jin)行(xing)預(yu)實驗，確(que)保抗L-乳(ru)酰(xian)賴氨(an)酸抗體(ti)偶(ou)聯瓊脂(zhi)糖(tang)珠的(de)富集效(xiao)率(lv)在不同(tong)批(pi)次和供應商(shang)之間(jian)保持壹(yi)致

41.將(jiang)凍幹肽(tai)重懸於1 mL乳(ru)酰(xian)肽(tai)binding buffer中(zhong)。渦(wo)旋或(huo)超(chao)聲處(chu)理是確(que)保肽(tai)溶解的(de)必要措施(shi)

註意(yi)：在肽(tai)富集之前(qian)檢(jian)查溶(rong)液的(de)pH值。pH值應(ying)約(yue)為(wei)8.0

42. 在 4℃ 下(xia)以(yi) 13000 x g 離(li)心(xin) 10 分(fen)鐘，使(shi)溶(rong)液澄(cheng)清

43. 吸取10 μL Anti-L-lactyllysine agarose Beads，用(yong)1 mL乳(ru)酰(xian)肽(tai)binding buffer清洗微珠(zhu)。離(li)心(xin)使(shi)微珠(zhu)沈澱(dian)

44. 將(jiang)澄清的(de)肽(tai)溶液轉移到含有Anti-L-lactyllysine agarose Beads的(de)管中(zhong)，並(bing)在 4℃ 下(xia)旋轉孵育 4 小時

註意：為(wei)確(que)保乳(ru)酸化肽(tai)的(de)富集效(xiao)率(lv)，孵育時間應(ying)不少(shao)於(yu)4小時。不建(jian)議(yi)過夜孵育，因(yin)為(wei)過夜孵育會導致(zhi)更多的(de)非特異(yi)性(xing)結(jie)合(he)

45.通(tong)過離(li)心(xin)將(jiang)Beads沈澱(dian)下(xia)來(lai)

註(zhu)意：收集上(shang)清液作為(wei)備用(yong)，以(yi)防乳(ru)肽(tai)富集失敗(bai)。上(shang)清液可在-80℃保存長達1個(ge)月(yue)

46.用(yong) 1 mL lactylpeptide binding buffer在 4℃ 下(xia)旋轉清洗珠子兩次，每(mei)次 10 分(fen)鐘

47.用(yong) 1 mL lactylpeptide wash buffer 4℃下(xia)旋轉洗滌珠子兩次，每(mei)次 10 分(fen)鐘

48.在 4℃ 下(xia)旋轉，用 1 mL 50 mM  ammonium bicarbonate buffer進(jin)行(xing)最(zui)後清洗 10 分(fen)鐘

49.從(cong)珠(zhu)子中(zhong)洗(xi)脫(tuo)乳(ru)酸化肽(tai)段(duan)

• 用 100 μL  1% TFA 重懸珠子，室(shi)溫(wen)放(fang)置(zhi) 10 分(fen)鐘。離(li)心(xin)使(shi)珠(zhu)子沈澱(dian)，將(jiang)上(shang)清液收集到(dao)新的(de) 1.5 mL Eppendorf 管中(zhong)

• 用(yong) 50 μL  1% TFA 重懸珠子，旋轉孵育 10 分(fen)鐘。離(li)心(xin)使(shi)珠(zhu)子沈澱(dian)，將(jiang)上(shang)清液與第壹(yi)次洗脫(tuo)液(ye)合(he)並。

註意(yi)：可使用(yong) 0.22 mm 過濾(lv)器過濾(lv)溶液(ye)以去(qu)除殘留(liu)珠(zhu)子

• Stage-tip 脫(tuo)鹽(yan)

時間：2 小時

乳(ru)酰(xian)肽(tai)洗脫(tuo)液(ye)需要使用 C18 Stage-tip 進(jin)行(xing)凈(jing)化，以進(jin)行(xing)質譜分(fen)析。在本(ben)方(fang)案(an)中(zhong)，我們采(cai)用 Empore C18 固(gu)相萃取盤(pan) (2215-C18) 來(lai)進(jin)行(xing)Stage-tip。

註(zhu)意(yi)：應(ying)根(gen)據(ju)您(nin)的(de)階段(duan)吸頭(tou)調(tiao)整離(li)心(xin)速(su)度(du)，並確(que)保溶劑流(liu)速(su)保持在 5 μL /min

50. 用(yong) 20 μL 脫(tuo)鹽(yan)活化緩(huan)沖(chong)液(ye)調(tiao)節(jie)Stage-tip

51. 用(yong) 20 μL Stage-tip脫(tuo)鹽(yan)緩(huan)沖(chong)液(ye) B 清洗階段(duan)吸頭(tou)

52. 用(yong) 20 μL Stage-tip脫(tuo)鹽(yan)緩(huan)沖(chong)液(ye) A 平(ping)衡階段(duan)吸頭(tou)

53. 使(shi)乳(ru)酸化肽(tai)洗脫(tuo)液(ye)通(tong)過Stage-tip

54. 用 20 μL Stage tip 脫(tuo)鹽(yan)緩(huan)沖(chong)液(ye) A 對(dui)樣品進(jin)行(xing)脫(tuo)鹽(yan)

55. 將(jiang) Stage-tip 轉移至(zhi)新的(de) Eppendorf 管中(zhong)

56. 用(yong) 20 μL Stage-tip 脫(tuo)鹽(yan)緩(huan)沖(chong)液(ye) C 洗(xi)脫(tuo)肽(tai)。收集流(liu)穿(chuan)液

57. 用 20 μL Stage-tip 脫(tuo)鹽(yan)緩(huan)沖(chong)液(ye) B 洗(xi)脫(tuo)肽(tai)。將(jiang)流(liu)穿(chuan)液與第壹(yi)次洗脫(tuo)的(de)流(liu)穿(chuan)液合(he)並

58. 在 SpeedVac 離(li)心(xin)機(ji)中(zhong)幹(gan)燥(zao)洗脫(tuo)液(ye)

暫停點：此時(shi)樣(yang)品可在 -80℃ 下(xia)保存長達 1 周(zhou)

• LC-MS 分(fen)析

時(shi)間：數(shu)周(zhou)

作(zuo)者(zhe)描(miao)述了 Orbitrap Exploris 480 與 Easy-nLC 1200 系統的(de)聯用設(she)置(zhi)

59.準(zhun)備 LC-MS/MS 設(she)備

A、安裝(zhuang)足(zu)量的(de)新鮮流(liu)動(dong)相(xiang)溶(rong)劑(ji) A 和溶(rong)劑(ji) B。需要對溶劑 A 和 B 進(jin)行(xing)超(chao)聲處(chu)理以清除氣泡

B、用流(liu)動(dong)相(xiang)緩(huan)沖(chong)液(ye)沖(chong)洗(xi)泵(beng) A、泵 B 和泵(beng) S 中(zhong)的(de)空(kong)氣。沖(chong)洗(xi)閾值(zhi)為(wei) 10 μL

C、用 10 μL 的(de) 90% 溶劑 B 緩(huan)沖(chong)液(ye)激(ji)活分(fen)析柱(zhu)

D、通(tong)過運行(xing)空(kong)白(bai)樣(yang)品(pin)平(ping)衡分(fen)析柱(zhu)。確(que)保流(liu)動(dong)相(xiang)流(liu)路(lu)順(shun)暢(chang)

註(zhu)意(yi)：安裝(zhuang)流(liu)動(dong)相(xiang)溶(rong)劑(ji)、沖(chong)洗(xi)空(kong)氣和激(ji)活分(fen)析柱(zhu)可能需要 1小時。運行(xing)空(kong)白(bai)樣(yang)品(pin)可能需要 30 分(fen)鐘

60.制(zhi)備 Klac 富集樣(yang)品(pin)

A、將(jiang)富集的(de) Klac 肽(tai)溶解於 5 μL  0.1% 甲酸（溶劑(ji) A）中(zhong)

B、 4oC 下(xia)以(yi) 12,000x g 離(li)心(xin) 20 分(fen)鐘以(yi)去(qu)除不溶(rong)性(xing)物質。

C、將(jiang) 4.5 μL  上(shang)清液轉移到自動(dong)進(jin)樣(yang)器小瓶中(zhong)

D、將(jiang) 4 μL  樣品(pin)裝(zhuang)入 Easy-nLC 1200 HPLC

61. 制(zhi)備蛋(dan)白(bai)質組樣(yang)品(pin)。

A、用(yong) 20 μL  0.1% 甲酸（溶劑(ji) A）溶(rong)解(jie)步(bu)驟 39 中(zhong)分(fen)離(li)的(de)肽(tai)

B、在 4oC 下(xia)以(yi) 12,000x g 離(li)心(xin) 20 分(fen)鐘以(yi)去(qu)除不溶(rong)性(xing)物質

C、將(jiang) 18 μL  上(shang)清液轉移到自動(dong)進(jin)樣(yang)器小瓶中(zhong)

D、將(jiang) 1 μL  樣品(pin)裝(zhuang)入 Easy-nLC 1200 HPLC 中(zhong)

62. LC 梯(ti)度(du)設(she)置(zhi)如(ru)下(xia)圖所(suo)示(shi)

63、MS 參(can)數

使用(yong)以(yi)下(xia)參(can)數設(she)置(zhi) Orbitrap Exploris 480 的(de)質譜方(fang)法

A、正(zheng)離(li)子模式

B、噴(pen)霧電(dian)壓(ya)為(wei) 2.0 kV

註意：如果(guo)Steel emitter有(you)汙漬(zi)或(huo)磨損，導(dao)致噴霧(wu)不穩(wen)定，請(qing)將(jiang)噴霧(wu)電(dian)壓(ya)增(zeng)加(jia)到 2.1 kV

• 加(jia)熱毛(mao)細(xi)管溫(wen)度為(wei) 320oC

• 將(jiang)全 MS 分(fen)辨率(lv)設(she)置(zhi)為(wei) 60,000，最(zui)大註(zhu)射(she)時間為(wei) 25ms

• 將(jiang) MS1 質量範(fan)圍設(she)置(zhi)為(wei) 350–1400，AGC 目標設(she)置(zhi)為(wei) 1e6

• 使用 Top20 方法將(jiang) HCD 碎片譜圖(tu)分(fen)辨率(lv)設(she)置(zhi)為(wei) 15,000，最(zui)大進(jin)樣(yang)時(shi)間(jian)為(wei) 22 毫秒

• 將(jiang) MS2 質量範(fan)圍設(she)置(zhi)為(wei) 200–1400 m/z，AGC 目標設(she)置(zhi)為(wei) 5e4

• 將(jiang)最(zui)大進(jin)樣(yang)時(shi)間(jian)為(wei) 45 ms

• 將(jiang)隔離(li)窗口設(she)置(zhi)為(wei) 6 m/z，標準(zhun)化碰(peng)撞(zhuang)能量設(she)置(zhi)為(wei) 27%。

• 數據(ju)處(chu)理

時間：0.5 天(tian)

概(gai)述了使用(yong) MaxQuant 處(chu)理原(yuan)始(shi)文件的(de)方法。我們提(ti)供了設(she)置(zhi)新(xin)修(xiu)改的(de)詳細步(bu)驟以(yi)及(ji)無(wu)標記定量的(de)參(can)數。在本(ben)方(fang)案(an)中(zhong)，作(zuo)者(zhe)使(shi)用 MaxQuant（版本 2.0.3.0），並在 UniProtKB 人(ren)類(lei)完(wan)整蛋白(bai)質組序列(lie)數據(ju)庫中(zhong)搜(sou)索(suo)所(suo)有獲取(qu)的(de)原(yuan)始(shi)文件。請(qing)參(can)閱圖 2，了解 MaxQuant 用(yong)於(yu)分(fen)析這(zhe)些(xie)數據(ju)的(de)詳細參(can)數工作(zuo)流(liu)程(cheng)。其他軟(ruan)件，例如 Proteome Discoverer、pQuant 和 MSFragger，也可用於(yu)處(chu)理質譜原(yuan)始(shi)文件和進(jin)行(xing)非(fei)標(biao)記(ji)定量分(fen)析。

註(zhu)意：賴(lai)氨酸的(de)乳(ru)酸化會阻止胰(yi)蛋白(bai)酶(mei)消化賴氨酸 C 端(duan)。因(yin)此，我們建(jian)議(yi)在“乳(ru)酸化 (K)"中(zhong)選(xuan)擇(ze)“非(fei) C 端(duan)"。

圖 2 配(pei)置(zhi) MaxQuant 參(can)數以鑒(jian)定和定量乳(ru)酰(xian)肽(tai)

• 預(yu)期結(jie)果(guo)

在本(ben)方(fang)案(an)中(zhong)，作(zuo)者(zhe)執(zhi)行(xing)了壹(yi)個(ge)工作(zuo)流(liu)程(cheng)來(lai)高效(xiao)富集乳(ru)酰(xian)賴氨(an)酸肽(tai)。基(ji)於質譜分(fen)析，可以全面分(fen)析乳(ru)酰(xian)賴氨(an)酸修(xiu)飾(shi)，並量化對照細胞(bao)、AARS1/2 敲(qiao)低細胞和 AARS1/2 過表(biao)達細(xi)胞(bao)中(zhong)的(de)修(xiu)飾(shi)水(shui)平(ping)。下表(biao)顯示(shi)了使用(yong)本(ben)方案(an)中(zhong)描(miao)述的(de)工作(zuo)流(liu)程(cheng)在指定細胞(bao)中(zhong)鑒(jian)定出的(de)乳(ru)酰(xian)賴氨(an)酸修(xiu)飾(shi)位點(dian)數(shu)量。此(ci)外，圖 3 和圖(tu) 4 展(zhan)示(shi)了熱圖(tu)，描(miao)繪了各組乳(ru)酰(xian)賴氨(an)酸修(xiu)飾(shi)的(de)差異(yi)。

圖(tu) 3 熱圖(tu)顯示(shi)對照、AARS1 和/或(huo) AARS2 耗(hao)盡 (si-AARS1/si-AARS2) HEK293T 細胞(bao)中(zhong)整體(ti)賴(lai)氨酸乳(ru)酸組的(de)顏(yan)色編碼(ma)強度水(shui)平(ping)，用 PBS (Lac ''-'') 或(huo) L-乳(ru)酸 (Lac ''+'') 處(chu)理 24 小時

圖 4. 熱圖(tu)顯示(shi)了在用(yong)對(dui)照（AARS1-/AARS2 -）或(huo) AARS1/AARS2 表(biao)達質粒(li)（AARS1 +/ AARS2 +）轉染(ran)的(de) HeLa 細胞中(zhong)，整體(ti)賴(lai)氨酸乳(ru)酰(xian)化的(de)顏(yan)色編碼(ma)強度水(shui)平(ping)

斯(si)達特(te)乳(ru)酸化相關(guan)抗體(ti)

杭(hang)州斯(si)達特(te) 誌(zhi)在為(wei)全球生(sheng)命科(ke)學(xue)行(xing)業(ye)提(ti)供優質的(de)抗體(ti)、蛋(dan)白、試劑盒(he)等(deng)產(chan)品(pin)及(ji)研(yan)發服務。依托多個(ge)開發(fa)平(ping)臺：重組兔單抗(kang)、重組鼠(shu)單抗、快速(su)鼠(shu)單抗、重組蛋(dan)白(bai)開發(fa)平(ping)臺（E.coli,CHO,HEK293,InsectCells）,已(yi)正(zheng)式通(tong)過歐(ou)盟(meng)98/79/EC認(ren)證(zheng)、ISO9001認(ren)證(zheng)、ISO13485。

Cell Star Protocol 重磅解析： 無(wu)標簽(qian)定量賴(lai)氨(an)酸乳(ru)酸化蛋白組分(fen)析方(fang)案(an)