小(xiao)鼠膽管類(lei)器官(guan)的(de)體(ti)外構(gou)建(jian)：核心(xin)生(sheng)長(chang)因子(zi)與(yu)信(xin)號通路(lu)的(de)精密調(tiao)控

小(xiao)鼠膽管類(lei)器官(guan)是壹種(zhong)在體(ti)外三(san)維(wei)培(pei)養體(ti)系中(zhong)，由(you)膽管上(shang)皮細(xi)胞或幹細(xi)胞衍生(sheng)、自我組織形成的微(wei)型(xing)結(jie)構(gou)。該模型(xing)能(neng)模(mo)擬(ni)膽管的(de)上(shang)皮屏障(zhang)功(gong)能、分(fen)泌特性(xing)及(ji)對(dui)損(sun)傷的(de)應(ying)答(da)，其(qi)成功構(gou)建(jian)與(yu)長(chang)期培(pei)養高(gao)度(du)依賴於壹(yi)套(tao)精確的(de)細(xi)胞因子(zi)組(zu)合。

第壹(yi)部分：關(guan)鍵(jian)生(sheng)長(chang)因子(zi)的(de)核心(xin)作(zuo)用(yong)

膽管類(lei)器官(guan)的(de)體(ti)外構(gou)建(jian)依賴於幾(ji)種(zhong)關鍵(jian)生(sheng)長(chang)因子(zi)的(de)協同作(zuo)用(yong)，這些(xie)因子(zi)為(wei)細(xi)胞的增(zeng)殖與(yu)形態發(fa)生(sheng)提(ti)供(gong)了基礎信(xin)號支持。

表皮生(sheng)長(chang)因子(zi)（EGF）

表皮生(sheng)長(chang)因子(zi)是壹種(zhong)高(gao)效(xiao)的有(you)絲(si)分裂(lie)原(yuan)，在(zai)膽管類(lei)器官(guan)培(pei)養中(zhong)提(ti)供(gong)基礎的增(zeng)殖信(xin)號。EGF通過與(yu)其(qi)受體(ti)結(jie)合，激(ji)活下遊的MAPK和(he)PI3K-Akt等信(xin)號通路(lu)，直(zhi)接(jie)促進膽管上(shang)皮細(xi)胞的持(chi)續(xu)分裂(lie)與(yu)擴(kuo)增(zeng)。這種(zhong)廣泛(fan)的促(cu)增(zeng)殖作(zuo)用(yong)為(wei)類(lei)器官(guan)的(de)初(chu)始形成和(he)後(hou)續(xu)傳代擴(kuo)增(zeng)提(ti)供(gong)了必(bi)要(yao)的(de)生(sheng)長(chang)動力(li)。

成纖維(wei)細(xi)胞生(sheng)長(chang)因子(zi)（FGF）

成纖維(wei)細(xi)胞生(sheng)長(chang)因子(zi)家族成員(yuan)（特別是FGF10）是驅動膽管類(lei)器官(guan)形(xing)態構(gou)建(jian)的關(guan)鍵(jian)因子(zi)。FGF信(xin)號在膽管系(xi)統(tong)的胚(pei)胎發(fa)育中(zhong)起著核心(xin)作(zuo)用(yong)，在體(ti)外培(pei)養中(zhong)同樣指(zhi)導(dao)著類(lei)器官(guan)的(de)管腔(qiang)形(xing)成和(he)出芽(ya)生(sheng)長(chang)。它通過調(tiao)控細(xi)胞的極(ji)性(xing)建(jian)立和(he)定向(xiang)遷(qian)移(yi)，促進(jin)復(fu)雜(za)的三(san)維(wei)管網狀(zhuang)結(jie)構(gou)的生(sheng)成，這對(dui)於構(gou)建(jian)功能(neng)性(xing)的(de)膽管模(mo)型(xing)至關(guan)重要(yao)。

第二(er)部分：核心(xin)信(xin)號通路(lu)的(de)精密調(tiao)控

除(chu)了直接(jie)的生(sheng)長(chang)因子(zi)，幾(ji)條核心(xin)信(xin)號通路(lu)的(de)精確平(ping)衡(heng)對(dui)膽管類(lei)器官(guan)的(de)特異性(xing)分(fen)化(hua)與(yu)功能(neng)維(wei)持起著決定性(xing)作(zuo)用(yong)。

Wnt/β-catenin信(xin)號通路(lu)

Wnt信(xin)號通路(lu)是啟(qi)動膽管類(lei)器官(guan)形(xing)成的首(shou)要(yao)開(kai)關。適度(du)的Wnt信(xin)號激活（通常由(you)Wnt3a配體(ti)介(jie)導(dao)）能夠(gou)誘(you)導(dao)膽管上(shang)皮細(xi)胞的去分(fen)化(hua)和(he)增(zeng)殖，促(cu)進(jin)類(lei)器官(guan)的(de)初(chu)始形成。然(ran)而(er)，該通路(lu)的(de)活性(xing)需(xu)要(yao)被(bei)嚴(yan)格控制在(zai)特定水(shui)平(ping)，過(guo)度(du)或持(chi)續(xu)的Wnt信(xin)號激活反而(er)會抑制(zhi)膽管特異性(xing)標誌物的表達，幹擾其(qi)正常的(de)功(gong)能成熟。

TGF-β/BMP信(xin)號通路(lu)

轉(zhuan)化(hua)生(sheng)長(chang)因子(zi)-β和(he)骨(gu)形態發(fa)生(sheng)蛋(dan)白信(xin)號通路(lu)在(zai)膽管類(lei)器官(guan)中(zhong)構(gou)成壹個(ge)精密的(de)調(tiao)控網絡。與(yu)小(xiao)腸類(lei)器官(guan)需(xu)要(yao)強(qiang)力(li)抑制(zhi)BMP不(bu)同，膽管類(lei)器官(guan)的(de)培(pei)養需要(yao)適度(du)保留(liu)特定的(de)TGF-β/BMP信(xin)號活性(xing)。這些(xie)通路(lu)在(zai)誘導(dao)膽管特異性(xing)基(ji)因表達和(he)建(jian)立細(xi)胞極性(xing)中(zhong)發(fa)揮(hui)關鍵(jian)作(zuo)用(yong)。然(ran)而(er)，其(qi)濃度(du)平(ping)衡(heng)至關(guan)重要(yao)，過(guo)強(qiang)的(de)信(xin)號會誘導(dao)上(shang)皮-間(jian)質(zhi)轉(zhuan)化(hua)，導(dao)致(zhi)類(lei)器官(guan)結(jie)構(gou)破壞(huai)和(he)功能(neng)喪失。

第三(san)部分：小(xiao)鼠膽管類(lei)器官(guan)模(mo)型(xing)構(gou)建(jian)

小(xiao)鼠膽管類(lei)器官(guan)培(pei)養基（擴(kuo)增(zeng)）的制(zhi)備(bei)：將基(ji)礎培(pei)養基、細(xi)胞因子(zi)及(ji)各類(lei)添(tian)加(jia)物(wu)按既定比(bi)例混(hun)合(he)，配制(zhi)成培(pei)養基。

1、原(yuan)代

（1）在(zai)超凈臺裏(li)快速(su)剖(pou)開(kai)小(xiao)鼠腹(fu)腔(qiang)，取出肝組(zu)織，置(zhi)於預(yu)冷(leng)PBS（加(jia)青黴(mei)素(su)、鏈(lian)黴素(su)、原(yuan)代抗(kang)生(sheng)素(su)）中(zhong)清(qing)洗(xi)。

（2）將清(qing)洗(xi)後(hou)的組(zu)織塊收(shou)集(ji)到1.5ml EP管中(zhong)，使(shi)用(yong)無菌尖頭(tou)眼科手術剪將組(zu)織塊盡量剪碎(sui)(勻(yun)漿狀(zhuang)）。組(zu)織剪切程度(du)與(yu)消(xiao)化(hua)時間(jian)相(xiang)關(guan)，剪切程度(du)越高(gao)則(ze)消(xiao)化(hua)時間(jian)越短，將剪碎(sui)後(hou)的組(zu)織轉(zhuan)移(yi)至15ml無菌離(li)心管中(zhong)。

（3）加(jia)10倍(bei)體(ti)積的組(zu)織消(xiao)化(hua)液消(xiao)化(hua)，37℃震蕩10-30min，消(xiao)化(hua)過程中(zhong)隨(sui)時(shi)觀(guan)察(cha)情(qing)況。當(dang)視(shi)野(ye)中(zhong)觀(guan)察到有大(da)量細(xi)胞漏出，且大部分細(xi)胞呈細(xi)胞團塊時(shi)，可(ke)終止(zhi)消(xiao)化(hua)（註：不要(yao)消(xiao)化(hua)到單細(xi)胞狀(zhuang)態）。

（4）在(zai)確認(ren)消(xiao)化(hua)完(wan)成的組(zu)織懸液中(zhong)，加(jia)入胎牛血(xue)清（FBS）至終濃(nong)度(du)達2-5%或終濃(nong)度(du)為(wei)0.1%的BSA後(hou)吹打(da)混(hun)勻(yun)。

（5）將組(zu)織與(yu)細(xi)胞懸液過(guo)70µm細(xi)胞濾(lv)網，將過(guo)濾(lv)後(hou)的細(xi)胞懸液1000rpm，離(li)心5min，離(li)心後(hou)去上(shang)清。

（6）若離(li)心後(hou)沈澱(dian)中(zhong)觀(guan)察到明顯(xian)的(de)紅色沈澱(dian)（紅細(xi)胞），加(jia)入2ml紅細(xi)胞裂解(jie)液，吹(chui)打(da)混(hun)勻(yun)後(hou)放(fang)置(zhi)3min。加(jia)10ml PBS重(zhong)懸(xuan)終止(zhi)裂紅， 1000rpm 離(li)心5min後(hou)，棄上(shang)清。

（7）適量基礎培(pei)養基或PBS重(zhong)懸沈澱(dian)。

（8）以(yi)合適的(de)比(bi)例混(hun)合(he)基質(zhi)膠(jiao)和(he)細(xi)胞，24孔(kong)細(xi)胞培(pei)養板為(wei)例，每(mei)孔(kong)點膠(jiao)25-30ul基(ji)質(zhi)膠(jiao)混(hun)合(he)物進行(xing)鋪(pu)板（4℃下操(cao)作(zuo)）。

（9）將鋪(pu)好(hao)的培(pei)養板放(fang)入37℃培(pei)養箱(xiang)中(zhong)20-30min成膠(jiao)，添(tian)加(jia)適量小(xiao)鼠膽管類(lei)器官(guan)培(pei)養基（擴(kuo)增(zeng)）進行(xing)培(pei)養。

2、類(lei)器官(guan)傳(chuan)代培(pei)養

（1）移(yi)液槍(qiang)吸(xi)去培(pei)養基，每(mei)孔(kong)添(tian)加(jia)1-2ml 4℃ PBS，放(fang)置(zhi)2min。

（2）移(yi)液槍(qiang)輕(qing)柔(rou)吹打(da)基質(zhi)膠(jiao)，收(shou)集(ji)在15ml離(li)心管中(zhong)，PBS定(ding)容(rong)到10-14ml ，4℃靜置(zhi)20-30min，每(mei)3-5孔(kong)為(wei)壹組。1000rpm離(li)心5min棄去液體(ti)，保留(liu)沈澱(dian)。

（3）添(tian)加(jia)適量基質(zhi)膠(jiao)重(zhong)懸類(lei)器官(guan)，每(mei)孔(kong)25-30ul基(ji)質(zhi)膠(jiao)鋪(pu)在24孔(kong)細(xi)胞培(pei)養板中(zhong)，放(fang)置(zhi)培(pei)養箱(xiang)中(zhong)20-30min成膠(jiao)，添(tian)加(jia)適量小(xiao)鼠膽管類(lei)器官(guan)培(pei)養基（擴(kuo)增(zeng)）培(pei)養。

3、類(lei)器官(guan)凍(dong)存(cun)

（1）移(yi)液槍(qiang)吸(xi)去培(pei)養基，每(mei)孔(kong)添(tian)加(jia)1-2ml 4℃ PBS，放(fang)置(zhi)2min。

（2）移(yi)液槍(qiang)輕(qing)柔(rou)吹打(da)基質(zhi)膠(jiao)，收(shou)集(ji)在15ml離(li)心管中(zhong)，PBS定(ding)容(rong)到10-14ml ，4℃靜置(zhi)20-30min，每(mei)3-5孔(kong)為(wei)壹組。1000rpm離(li)心5min棄去液體(ti)，保留(liu)沈澱(dian)。

（3）添(tian)加(jia)適量類(lei)器官(guan)凍(dong)存(cun)液，輕(qing)柔(rou)吹打(da)重懸(xuan)，以(yi)24孔(kong)細(xi)胞培(pei)養板為(wei)例，密度(du)為(wei)2-3個孔(kong)凍(dong)存(cun)1管，每(mei)管體(ti)積1ml。

（4）做好(hao)標記(ji)信(xin)息，進行(xing)程(cheng)序降溫(wen)後(hou)，移(yi)入液氮(dan)長(chang)期保存(cun)。

4、類(lei)器官(guan)復(fu)蘇(su)

（1）取(qu)10ml DMEM/F12基礎培(pei)養基於15ml離(li)心管中(zhong)。

（2）從(cong)液氮(dan)罐(guan)中(zhong)取(qu)出凍存(cun)的(de)類(lei)器官(guan)，快(kuai)速(su)置(zhi)於 37℃水(shui)浴鍋(guo)中(zhong)融(rong)解(jie)。

（3）水浴融(rong)解(jie)過程(cheng)中(zhong)，需(xu)輕(qing)輕(qing)搖(yao)動冷(leng)凍(dong)管，以(yi)確保凍(dong)存(cun)液在(zai) 1-2min內(nei)融(rong)解(jie)。

（4）將溶解(jie)後(hou)的類(lei)器官(guan)快(kuai)速(su)轉(zhuan)移(yi)至15ml 離(li)心管，使(shi)用(yong)移(yi)液器輕(qing)輕(qing)吹(chui)打(da)6-8次(ci)，1000rpm離(li)心 5min，然(ran)後(hou)除(chu)去上(shang)清液並(bing)收(shou)集(ji)類(lei)器官(guan)沈澱(dian)。

（5）基(ji)質(zhi)膠(jiao)重(zhong)懸，每(mei)孔(kong)25-30ul基(ji)質(zhi)膠(jiao)鋪(pu)在24孔(kong)細(xi)胞培(pei)養板中(zhong)，放(fang)置(zhi)培(pei)養箱(xiang)中(zhong)20-30min成膠(jiao)，添(tian)加(jia)適量小(xiao)鼠膽管類(lei)器官(guan)培(pei)養基（擴(kuo)增(zeng)）。

Cholangiocyte Organoid Expansion Cytokine Set, Mouse /小(xiao)鼠膽管類(lei)器官(guan)（擴(kuo)增(zeng)）細(xi)胞因子(zi)套(tao)裝(zhuang)_UA090044_優愛(UA BIOSCIENCE)

優(you)愛(ai)蛋(dan)白（UA Bio）,重組蛋(dan)白專家

優愛(ai)蛋(dan)白專註於提(ti)供(gong)藥物研(yan)發(fa)、細(xi)胞治(zhi)療(liao)、基因治(zhi)療(liao)、基礎科研(yan)所(suo)需各種(zhong)蛋(dan)白類(lei)試(shi)劑(ji)原(yuan)材料(liao)和(he)服務(wu)，包括(kuo)藥物靶(ba)點蛋(dan)白、免疫(yi)檢查點蛋(dan)白、細(xi)胞因子(zi)、工(gong)具(ju)酶、 蛋(dan)白定制表達、全長(chang)跨膜(mo)蛋(dan)白開(kai)發(fa)等。優(you)愛(ai)致(zhi)力(li)於為(wei)客戶(hu)提(ti)供(gong)優質(zhi)的(de)產品和(he)專業(ye)服(fu)務(wu)，打(da)造(zao)具有(you)國際(ji)競爭力(li)的高(gao)新(xin)技(ji)術企(qi)業(ye)。