如何(he)利(li)用非天(tian)然氨(an)基酸開發高選擇性去泛(fan)素(su)化酶(mei)探(tan)針(zhen)？

1. 如何(he)開發高選擇性去泛(fan)素(su)化酶(mei)（DUB）化學探(tan)針(zhen)？

去泛素(su)化酶(mei)（DUBs）在細(xi)胞(bao)內(nei)負責(ze)移除(chu)蛋(dan)白(bai)質上的(de)泛素(su)修飾，在病(bing)毒(du)感(gan)染(ran)、神(shen)經(jing)退(tui)行(xing)性疾病(bing)及癌癥等多種(zhong)病(bing)理過(guo)程中(zhong)發揮關鍵(jian)作(zuo)用(yong)，是(shi)具(ju)潛力的治(zhi)療(liao)靶(ba)點(dian)。人類(lei)基因組(zu)編(bian)碼(ma)約100種(zhong)DUB，然(ran)而(er)目前缺乏能夠(gou)特異(yi)性識別(bie)並(bing)表征其活性的化學工具(ju)，限(xian)制了在生(sheng)理與(yu)病(bing)理條件下(xia)對其功能的研(yan)究(jiu)。盡(jin)管(guan)商品化的(de)廣譜熒(ying)光(guang)底物（如C端(duan)泛(fan)素(su)序列或(huo)熒(ying)光(guang)標(biao)記泛(fan)素(su)分子）已(yi)廣泛(fan)應(ying)用於(yu)DUB的(de)生(sheng)化分析，但(dan)仍(reng)亟需開發能夠(gou)針(zhen)對單個(ge)DUB的(de)高(gao)選(xuan)擇性探(tan)針(zhen)。

2. 如何(he)利(li)用非天(tian)然氨(an)基酸篩選DUB的底(di)物偏好？

來(lai)自波(bo)蘭弗(fu)羅(luo)茨瓦(wa)夫理工大(da)學的Marcin Drag教(jiao)授和(he)Wioletta Rut教(jiao)授團隊在Chemical Science上發表了壹項研(yan)究(jiu)，致(zhi)力於(yu)構建基於(yu)泛(fan)素(su)（Ub）支架的高選擇性DUB化學探(tan)針(zhen)。該策(ce)略(lve)的(de)核(he)心(xin)是(shi)將(jiang)非天(tian)然氨(an)基酸引入(ru)保守(shou)的(de)C端Ub序(xu)列，以系(xi)統篩選DUB的底(di)物識別(bie)偏好。

研(yan)究(jiu)以(yi)兩種重(zhong)要(yao)的癌癥相(xiang)關(guan)DUB——MERS PLpro和(he)UCH-L3為(wei)模(mo)型，構建了兩類(lei)化學底物文庫：壹(yi)類(lei)用於(yu)篩選P2位點(dian)偏好（Ac-Leu-Arg-P2-Gly-ACC），另(ling)壹類(lei)為(wei)混(hun)合(he)底(di)物文庫，用(yong)於(yu)評估(gu)P3和(he)P4位(wei)點(dian)的特異(yi)性。篩選結(jie)果顯示，MERS PLpro在P2位點(dian)偏好甘(gan)氨(an)酸，而(er)UCH-L3更傾向脂(zhi)肪(fang)族(zu)氨(an)基酸；在P3位點(dian)，UCH-L3強烈偏(pian)好精(jing)氨(an)酸，MERS PLpro則(ze)更接受疏(shu)水(shui)性殘(can)基。基於(yu)這些(xie)特(te)異(yi)性圖(tu)譜，作(zuo)者(zhe)合(he)成(cheng)了相(xiang)應(ying)底(di)物，並(bing)經(jing)由動力學實(shi)驗(yan)驗(yan)證(zheng)了其高選(xuan)擇性。

3. 能否(fou)構建具(ju)有選擇性的泛(fan)素(su)基不可逆(ni)探(tan)針(zhen)？

在明確底物特異(yi)性的基礎(chu)上，作(zuo)者(zhe)進壹步設(she)計了基於(yu)Ub的(de)活性探(tan)針(zhen)。這些(xie)探(tan)針(zhen)在N端引入(ru)檢測標(biao)簽（如生(sheng)物素(su)），C端則嫁接不可逆(ni)親電基團——乙烯(xi)基甲(jia)基酯(zhi)（VME），該集團可廣泛(fan)與(yu)DUB活性位點(dian)共價結(jie)合(he)。

酶(mei)動(dong)力學分析表明(ming)，所(suo)構建的(de)B-Ub-UCHL3-2-VME和(he)B-Ub-MERS27-VME分別(bie)對UCH-L3和(he)MERS PLpro表現(xian)出(chu)高效(xiao)和(he)特(te)異性標(biao)記能力，其效果優於(yu)野生(sheng)型Ub-ACC底物。後續(xu)在細(xi)胞(bao)裂(lie)解(jie)液中(zhong)的實(shi)驗(yan)進壹步證(zheng)實(shi)了這些(xie)探(tan)針(zhen)具有良(liang)好的(de)選擇性和(he)細(xi)胞(bao)活性。

4. 該策(ce)略(lve)是(shi)否(fou)為(wei)DUB研(yan)究(jiu)提供通用(yong)化工(gong)具開發平(ping)臺(tai)？

本研(yan)究(jiu)通過(guo)將(jiang)非天(tian)然氨(an)基酸嵌(qian)入泛(fan)素(su)分子框架(jia)，成功開發出(chu)壹套活性與(yu)選擇性兼具(ju)的(de)DUB化學探(tan)針(zhen)構建策(ce)略(lve)。該(gai)方法(fa)不僅適(shi)用(yong)於(yu)UCH-L3和(he)MERS PLpro，更具潛力推廣至(zhi)其他DUB及(ji)泛素(su)類(lei)似(si)特(te)異(yi)性蛋(dan)白(bai)酶的(de)研(yan)究(jiu)中(zhong)，為(wei)探(tan)索DUB在疾病(bing)中(zhong)的作(zuo)用(yong)機(ji)制(zhi)及(ji)開發靶(ba)向(xiang)療(liao)法(fa)提供了強有力的化學工具(ju)。