IF：27.4！斯(si)達特(te)二(er)抗助力高效(xiao)RNA遞(di)送(song)研(yan)究(jiu)！

自新冠(guan)之後(hou)LNP 進行(xing)RNA遞(di)送(song)，壹(yi)直(zhi)是(shi)壹個非(fei)常熱(re)門(men)的研究方(fang)向(xiang)。2025年2月(yue)初(chu)，天(tian)津(jin)大(da)學王躍(yue)飛(fei)團(tuan)隊(dui)在(zai) 《Advance Materials》期(qi)刊上發表《Modular Design of Lipopeptide-Based Organ-Specific Targeting (POST) Lipid Nanoparticles for Highly Efficient RNA Delivery》。該文(wen)主要(yao)研究了基於(yu)脂(zhi)肽(tai)（lipopeptide, LP）的模塊化(hua)設計(ji)，開(kai)發了壹(yi)種(zhong)具(ju)有(you)高效(xiao)RNA遞(di)送(song)能力(li)和器(qi)官特(te)異性靶向(xiang)能力(li)的(de)脂(zhi)質(zhi)納米(mi)顆(ke)粒（lipid nanoparticles, LNPs），並(bing)命(ming)名為(wei)POST（Organ-Specific Targeting）LNPs。

1. 研(yan)究(jiu)背(bei)景

RNA療(liao)法(fa)在(zai)治療(liao)癌(ai)癥(zheng)、傳染病(bing)、遺(yi)傳性疾(ji)病(bing)等(deng)多種疾(ji)病(bing)中顯(xian)示出巨(ju)大(da)潛(qian)力。脂(zhi)質(zhi)納米(mi)顆(ke)粒（LNPs）是(shi)目前(qian)最(zui)有(you)前(qian)景的(de)RNA遞(di)送(song)系(xi)統之壹，其典型(xing)成分(fen)包括(kuo)可(ke)電(dian)離脂(zhi)質(zhi)、輔助脂(zhi)質(zhi)、膽(dan)固醇(chun)和PEG化(hua)脂(zhi)質(zhi)。然(ran)而，LNPs在(zai)應(ying)用中面(mian)臨(lin)的壹(yi)個關(guan)鍵挑(tiao)戰是(shi)其在(zai)體內(nei)的系(xi)統性肝(gan)積累(lei)，限制(zhi)了其在(zai)肝(gan)外器(qi)官的靶向(xiang)能力(li)。近(jin)年來(lai)，研(yan)究(jiu)者(zhe)們(men)通過(guo)篩選(xuan)可(ke)電(dian)離脂(zhi)質(zhi)結構、添(tian)加主動靶向(xiang)配(pei)體以及(ji)調節(jie)輔助脂(zhi)質(zhi)或膽(dan)固醇(chun)的性(xing)質等(deng)方法(fa)，取得(de)了壹(yi)定進(jin)展(zhan)。例如(ru)，通過(guo)引(yin)入(ru)第(di)五(wu)種(zhong)選(xuan)擇性(xing)器(qi)官靶向(xiang)（SORT）輔助脂(zhi)質(zhi)，實(shi)現(xian)了(le)對(dui)脾(pi)臟、肺(fei)和骨(gu)髓(sui)的(de)精準(zhun)mRNA遞(di)送(song)。

2. 研(yan)究(jiu)目的(de)

本(ben)研究(jiu)旨在(zai)開(kai)發壹種(zhong)高效(xiao)的可(ke)電(dian)離脂(zhi)質(zhi)，通過(guo)脂(zhi)肽(tai)（LPs）的模塊化(hua)設計(ji)，構建具(ju)有(you)器(qi)官特(te)異性靶向(xiang)能力(li)的(de)LNPs。脂(zhi)肽(tai)結合(he)了(le)肽(tai)的生(sheng)物(wu)相(xiang)容(rong)性、可(ke)設計(ji)性和靶向(xiang)性(xing)，以(yi)及(ji)脂(zhi)質(zhi)的疏水性，有(you)望提升LNPs的(de)RNA遞(di)送(song)效(xiao)率和靶向(xiang)性(xing)。

3. 研(yan)究(jiu)方法(fa)

脂(zhi)肽(tai)（LPs）的設計(ji)與合(he)成

研究(jiu)者設計(ji)並合(he)成了壹(yi)系列基於(yu)賴(lai)氨(an)酸(suan)-組氨(an)酸(suan)的脂(zhi)肽(tai)（KH-LPs），其結構包括(kuo)壹個極(ji)性頭（KHn，n為(wei)氨(an)基酸(suan)數量，2-12）和壹(yi)個非(fei)極(ji)性尾(wei)（Ax或Ex，A表示烷醇(chun)，E表示烯(xi)醇(chun)，x為(wei)碳(tan)原子(zi)數量，10-18）。通過(guo)簡單(dan)的壹(yi)步環開(kai)反(fan)應(ying)，合(he)成了25種(zhong)不同的KH-LPs，並將(jiang)其與四(si)種(zhong)輔助脂(zhi)質(zhi)（DOTAP、DOPE、DSPC和14PA）組(zu)合(he)，構(gou)建(jian)了包含(han)100種四(si)組分(fen)LP-LNPs的篩(shai)選(xuan)庫。

篩(shai)選(xuan)策略

研究(jiu)者通過(guo)體外和體內(nei)篩選(xuan)，評估了(le)這些(xie)KH-LP LNPs在(zai)遞(di)送(song)mRNA和siRNA方(fang)面(mian)的(de)能力(li)。體外篩(shai)選(xuan)使(shi)用(yong)人肺(fei)癌(ai)細胞A549作(zuo)為(wei)測(ce)試(shi)細胞，通過(guo)流式細胞術檢測(ce)mRNA表達效(xiao)率和siRNA沈(chen)默效(xiao)率。體內(nei)篩選(xuan)則(ze)通過(guo)在(zai)C57BL/6小(xiao)鼠中註(zhu)射(she)封裝了熒(ying)光(guang)素酶mRNA的LNPs，觀(guan)察(cha)其在(zai)不(bu)同器官中的(de)生(sheng)物(wu)發光(guang)信號(hao)，以(yi)評(ping)估器(qi)官靶向(xiang)性(xing)和遞(di)送(song)效(xiao)率。

基於(yu)賴(lai)氨(an)酸(suan)-組氨(an)酸(suan)的脂(zhi)肽(tai)庫（KH-LP）和基於(yu)四(si)組(zu)分(fen)脂(zhi)肽(tai)的器官特(te)異性靶向(xiang)（POST）LNP篩(shai)選(xuan)庫的(de)模(mo)塊化(hua)設計(ji)

4. 實(shi)驗(yan)結果

體外篩(shai)選(xuan)結果

在(zai)95種(zhong)細胞毒性(xing)較低（細胞存(cun)活(huo)率(lv)>80%）的(de)KH-LP LNPs中，16種(zhong)在(zai)A549細胞中實(shi)現(xian)了(le)超過(guo)70%的mRNA表達效(xiao)率，其中A10-KH2/DOTAP表現最(zui)佳(jia)，達到96.8%。

在(zai)siRNA遞(di)送(song)方(fang)面(mian)，29種(zhong)KH-LP LNPs實(shi)現(xian)了(le)低於(yu)20%的(de)靶基因(yin)mRNA相(xiang)對(dui)表達水(shui)平，A10-KH2/DOTAP同(tong)樣(yang)表現最(zui)佳(jia)，沈(chen)默效(xiao)率達(da)到97.3%。

進(jin)壹步測(ce)試(shi)表明(ming)，A10-KH2/DOTAP在(zai)多(duo)種難以(yi)轉染的細胞系中均(jun)表現出優異的mRNA和siRNA遞(di)送(song)能力(li)，優於(yu)商業(ye)轉(zhuan)染試劑(ji)和經典的(de)SM-102 LNP。

結構-活(huo)性(xing)關(guan)系（SAR）分(fen)析

研究(jiu)發現，高效(xiao)的KH-LP LNPs通常具(ju)有(you)以(yi)下(xia)特(te)性：pKa值在(zai)6-7之間（有(you)利(li)於(yu)RNA遞(di)送(song)）、包封率(lv)（ee）>80%、粒徑(jing)<120 nm、多分(fen)散指(zhi)數（PDI）<0.2，且(qie)在(zai)中性(xing)條(tiao)件下zeta電(dian)位(wei)接近(jin)中性(xing)。

不(bu)同的(de)輔助脂(zhi)質(zhi)系統對(dui)KH-LPs的(de)選(xuan)擇性(xing)不(bu)同。例(li)如(ru)，DOTAP（正(zheng)電(dian)荷）更(geng)適合(he)與短鏈KHn頭結合(he)，而DOPE、DSPC和14PA（弱(ruo)RNA結合(he)能力(li)）則(ze)更(geng)適合(he)與長(chang)鏈KHn頭結合(he)，以(yi)實(shi)現(xian)高效(xiao)的RNA結合(he)、細胞攝(she)取(qu)和內(nei)質網逃(tao)逸(yi)。

體內(nei)篩選(xuan)結果

在(zai)體內(nei)實(shi)驗(yan)中，A10-KH2/DOTAP表現出肺(fei)部(bu)特(te)異性靶向(xiang)能力(li)，其生(sheng)物(wu)發光(guang)信號(hao)強(qiang)度高於(yu)經典的(de)肺(fei)部(bu)靶向(xiang)LNP（如(ru)SORT MC3/DOTAP LNP）。

A10-KH4/DOPE和A18-KH4/DOPE分(fen)別在(zai)肝(gan)臟和脾(pi)臟中表現出高效(xiao)遞(di)送(song)能力(li)，且(qie)優於(yu)或(huo)至(zhi)少(shao)與經典的(de)肝(gan)臟靶向(xiang)LNP和脾(pi)臟靶向(xiang)LNP相(xiang)當(dang)。

通過(guo)冷(leng)凍透射電(dian)子顯微(wei)鏡(jing)（cryo-TEM）觀(guan)察(cha)，POST LNPs呈(cheng)球(qiu)形(xing)，具(ju)有(you)多(duo)層(ceng)外(wai)殼(ke)和非(fei)晶態核心(xin)。

siRNA遞(di)送(song)能力(li)

在(zai)體內(nei)siRNA遞(di)送(song)實(shi)驗(yan)中，POST LNPs在(zai)靶向(xiang)器(qi)官中表現出更(geng)高的(de)特(te)異性和沈(chen)默效(xiao)率，優於(yu)對(dui)應(ying)的SORT LNPs

在(zai)劑(ji)量依賴(lai)性(xing)實(shi)驗(yan)中，肺(fei)和肝(gan)臟POST LNPs在(zai)0.1 mg/kg劑(ji)量下仍能實(shi)現(xian)超(chao)過(guo)50%的沈(chen)默效(xiao)率，而脾(pi)臟POST LNP在(zai)0.01 mg/kg劑(ji)量下即可(ke)達到超(chao)過(guo)50%的沈(chen)默效(xiao)率

穩(wen)定性(xing)和生(sheng)物(wu)相(xiang)容(rong)性

POST LNPs在(zai)4°C下(xia)儲(chu)存(cun)9天(tian)後(hou)，其mRNA遞(di)送(song)能力(li)、粒(li)徑(jing)、PDI和包封率(lv)均保持穩(wen)定。

在(zai)重(zhong)復給藥實(shi)驗(yan)中，小(xiao)鼠在(zai)連續三(san)次(ci)給藥後(hou)，靶向(xiang)器(qi)官中PTEN基因(yin)水(shui)平持續(xu)保持低水平(ping)，且(qie)小(xiao)鼠體重呈(cheng)上升趨勢(shi)，表明(ming)POST LNPs具(ju)有(you)良(liang)好(hao)的(de)生(sheng)物(wu)相(xiang)容(rong)性。

5. 結論

本(ben)研究(jiu)通過(guo)模塊(kuai)化(hua)設計(ji)的KH-LPs和輔助脂(zhi)質(zhi)，成功開(kai)發了壹(yi)系(xi)列具(ju)有(you)高效(xiao)RNA遞(di)送(song)能力(li)和器(qi)官特(te)異性靶向(xiang)能力(li)的(de)POST LNPs。這(zhe)些(xie)LNPs在(zai)體外和體內(nei)實(shi)驗(yan)中均(jun)表現出優異的性能，具(ju)有(you)簡單(dan)組成、良好(hao)穩定性(xing)和生(sheng)物(wu)相(xiang)容(rong)性，顯(xian)示出巨(ju)大(da)的(de)臨(lin)床應用(yong)潛(qian)力。此(ci)外(wai)，SAR分(fen)析結果表明(ming)，通過(guo)精確(que)調節(jie)LP的(de)結構和功(gong)能，可(ke)以為(wei)不(bu)同(tong)的(de)靶向(xiang)脂(zhi)質(zhi)系統開(kai)發出可(ke)電(dian)離成分(fen)，為(wei)未(wei)來(lai)的(de)RNA療(liao)法(fa)提供了(le)新的策略。

這項研究(jiu)不(bu)僅(jin)為(wei)RNA遞(di)送(song)系(xi)統的設計(ji)提供了(le)新的思路，還為(wei)開(kai)發具(ju)有(you)器(qi)官特(te)異性靶向(xiang)能力(li)的(de)納(na)米(mi)藥物(wu)提(ti)供了(le)重要(yao)的理論依(yi)據。通過(guo)模塊(kuai)化(hua)設計(ji)和篩(shai)選(xuan)策略，可(ke)以針對(dui)不(bu)同的(de)疾(ji)病(bing)和靶器官開(kai)發出個性化(hua)的(de)RNA遞(di)送(song)系(xi)統，有(you)望推動RNA療(liao)法(fa)在(zai)臨(lin)床中的(de)應(ying)用。

S-RMab®單(dan)克隆(long)抗體

文(wen)中使(shi)用(yong)斯(si)達(da)特(te)熒(ying)光(guang)標(biao)簽偶聯抗體Goat anti-Rabbit IgG(H+L) (Alexa Fluor® 594 Conjugate) （貨(huo)號(hao)S0B4007）和Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488 Conjugate）（貨(huo)號(hao)S0B4017）進(jin)行(xing)免疫熒(ying)光(guang)實(shi)驗(yan)。實(shi)驗(yan)流(liu)程如下(xia)：

1.裝載mEGFP的POST LNP通過(guo)靜脈註射於(yu)C57BL/6小(xiao)鼠（劑(ji)量為(wei)0.75mgkg−1）

2.48 h後(hou)，分(fen)離相(xiang)應(ying)的(de)靶向(xiang)組(zu)織(zhi)（肝(gan)、脾(pi)、肺(fei)），制(zhi)備冷(leng)凍切片(pian)（8 μm），用(yong)95%乙醇(chun)固定10 min

3.切片(pian)用(yong)PBS洗滌(di)3次(ci)，用(yong)0.1% Triton X100滲(shen)透(tou)30 min，用(yong)5%正常山羊(yang)血清(qing)封閉(bi)1h

4.使(shi)用(yong)壹(yi)抗在(zai)4°C下(xia)孵育過(guo)夜

5.清(qing)洗載玻(bo)片(pian)，使(shi)用(yong)斯(si)達(da)特(te)二(er)抗（1:500 dilution ）在(zai)室(shi)溫下孵育1小(xiao)時

6.洗滌(di)，用(yong)4′,6-diamidino-2-phenylindole孵育5 min，並封片(pian)

7.采用奧林巴斯IX73顯(xian)微(wei)鏡(jing)進(jin)行(xing)成像

8.以1xPBS為(wei)陰(yin)性(xing)對(dui)照(zhao)。